在第3次和第4次KA誘導(dǎo)后的前兩天的監(jiān)控錄像中我們觀(guān)察到，食蟹獼猴表現(xiàn)出由左側(cè)前肢開(kāi)始的自發(fā)性痙攣，接著是直立和平衡喪失，每天跌倒約5~10次。但是在慢性期沒(méi)有觀(guān)察到這樣的現(xiàn)象。

在食蟹獼猴最后一次接受KA注射后的三個(gè)月里，連續(xù)4周以每周一次的頻率記錄持續(xù)60分鐘的EEG腦電。如圖所示，在的腦電結(jié)果中我們觀(guān)察到了大量位于顳葉棘波（15~90次/30 min）。95%的棘波出現(xiàn)在右側(cè)顳葉，在左側(cè)顳葉也檢測(cè)到同步的棘波。

EEG腦電顯示，每次發(fā)作會(huì)有持續(xù)10~15秒的高頻同步放電活動(dòng)，猴子也表現(xiàn)出凝視和刻板樣行為。隨后，猴子出現(xiàn)緩慢轉(zhuǎn)頭和舔唇動(dòng)作。在慢性癲癇階段的EEG腦電圖記錄中，我們沒(méi)有監(jiān)測(cè)到全身性陣攣性發(fā)作或運(yùn)動(dòng)癥狀。這種表現(xiàn)與顳葉癲癇的臨床表現(xiàn)一致，因?yàn)樵陲D葉癲癇患者中也很少出現(xiàn)全身性陣攣性發(fā)作。

為了評(píng)估顳葉癲癇模型的建模效果，我們對(duì)處于慢性癲癇期的猴子進(jìn)行了長(zhǎng)期連續(xù)的視頻記錄。與預(yù)期一致，在注射KA后的 3~6個(gè)月，在任何猴子身上都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的驚厥發(fā)作。這與之前的報(bào)道一致，該研究發(fā)現(xiàn)在自發(fā)性癲癇的慢性階段，接受顳葉癲癇造模處理的獼猴沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的驚厥發(fā)作。

創(chuàng)新性

以往的非人靈長(zhǎng)類(lèi)顳葉癲癇模型均為恒河猴模型，食蟹猴相比于恒河猴具有體積小、便于實(shí)驗(yàn)操作的優(yōu)點(diǎn)。

動(dòng)物模型的制備和應(yīng)用實(shí)驗(yàn)在具備相應(yīng)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。動(dòng)物模型的制備、應(yīng)用過(guò)程中的監(jiān)督管理、處置措施、對(duì)環(huán)境和生態(tài)影響等應(yīng)符合國(guó)家相關(guān)法律規(guī)定。

1. KA注射后誘導(dǎo)急性癲癇發(fā)作

KA注射后約30 min，食蟹猴開(kāi)始從麻醉中蘇醒，開(kāi)始出現(xiàn)分泌唾液，呼吸加快，單個(gè)肢體不自主抽搐進(jìn)而演變成雙側(cè)肢體不自主抽搐，全身性強(qiáng)直-陣攣性抽搐。發(fā)作約60 min后在沒(méi)有抗癲癇治療的情況下恢復(fù)正常。

2. 病理驗(yàn)證

如果對(duì)急性癲癇發(fā)作后死亡的食蟹猴進(jìn)行大腦病理解剖，經(jīng)過(guò)蘇木素染色后的病理結(jié)果顯示，注射位點(diǎn)位于海馬齒狀回區(qū)域，海馬CA3區(qū)域錐體神經(jīng)元發(fā)生神經(jīng)元核固縮，存在大量死亡的現(xiàn)象。

3. KA注射前后的腦電記錄驗(yàn)證（圖示見(jiàn)“有助于動(dòng)物模型鑒定和評(píng)價(jià)的其它材料”）

注射前腦電以慢波（θ波）為主，無(wú)明顯尖波和棘波（圖 2A）。

急性期癲癇樣尖波首先在注射側(cè)顳葉出現(xiàn)，隨后擴(kuò)散至前額葉（圖 2B）。腦電記錄中可觀(guān)察到5-9Hz高波幅節(jié)律性癲癇樣尖波。約10min后食蟹猴進(jìn)入狀態(tài)性癲癇發(fā)作，腦電中觀(guān)察到雙側(cè)對(duì)稱(chēng)爆發(fā)性10-14 Hz節(jié)律性尖波（圖 2D）以及出現(xiàn)肌電干擾（圖 2C），食蟹猴表現(xiàn)出肢體顫動(dòng)。狀態(tài)性癲癇發(fā)作過(guò)程維持約60 min。注射生理鹽水組食蟹猴在注射前后腦電信號(hào)沒(méi)有顯著變化。

4. KA注射3個(gè)月后的腦電驗(yàn)證（圖示見(jiàn)“有助于動(dòng)物模型鑒定和評(píng)價(jià)的其它材料”）

該模型在KA注射后具有自發(fā)性的癲癇異常放電。在KA注射后3個(gè)月，麻醉后通過(guò)腦電記錄，可檢測(cè)到整個(gè)大腦的尖波異常放電。證實(shí)模型建立成果，具有癲癇發(fā)作慢性期的自發(fā)性異常尖波放電。如果沒(méi)有檢測(cè)到慢性期的異常腦電，說(shuō)明建模不成功，原因可能是KA誘導(dǎo)的急性癲癇發(fā)作程度不夠，導(dǎo)致初始的海馬損傷不夠強(qiáng)烈。

5. 公開(kāi)發(fā)表的論文依據(jù)

本模型建立的相關(guān)工作發(fā)表于國(guó)際研究期刊：Chen T, et al. A cynomolgus monkey model of temporal lobe epilepsy.Brain Research Bulletin, 2019, 144(187-193).

實(shí)驗(yàn)材料

8-10歲食蟹猴雌性四只，雄性2只，4ug/ul/kg KA工作液，3%的戊巴比妥鈉溶液，3% H2O2，75%醫(yī)用酒精，醫(yī)用消毒脫脂棉，醫(yī)用消毒棉簽，手術(shù)器械，手術(shù)縫合線(xiàn)，非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物立體定位注射儀，醫(yī)用小動(dòng)物打孔器，電動(dòng)理發(fā)機(jī)，一次性醫(yī)用注射器，微量注射玻璃針，非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物固定架。

實(shí)驗(yàn)環(huán)境

屏障環(huán)境，非人靈長(zhǎng)類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專(zhuān)用手術(shù)間。

實(shí)驗(yàn)方法

1. 食蟹猴麻醉，一次性醫(yī)用注射器靜脈注射3%的戊巴比妥鈉溶液（1 kg/ml），食蟹猴深度麻醉后（顳子輕輕夾腳趾無(wú)反應(yīng)，呼吸均勻）轉(zhuǎn)移到非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物立體定位注射儀上，固定頭部。

2. 食蟹猴轉(zhuǎn)移到非人靈長(zhǎng)類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專(zhuān)用手術(shù)間，食蟹猴和手術(shù)人員全身消毒。

3. 用電動(dòng)理發(fā)機(jī)剪剪去食蟹猴頭部毛發(fā)，暴露頭皮，75%醫(yī)用酒精和碘伏依次消毒皮膚3遍，用消毒后的手術(shù)刀切開(kāi)右側(cè)頂骨皮膚，位于海馬正上方，切口長(zhǎng)度約10 mm，暴露顱骨。

4. 用醫(yī)用棉簽蘸取3% H2O2，輕輕擦拭顱骨表面組織；醫(yī)用棉簽蘸取75%醫(yī)用酒精擦去殘留的H2O2，醫(yī)用棉簽擦凈顱骨表面。

5. 牙科打孔器打出直徑約1 mm的孔洞，到硬腦膜止。

6. 用立體定位方法定向單側(cè)海馬CA區(qū)注射海人酸（kainic acid，KA）。注射位點(diǎn)為食蟹獼猴右側(cè)海馬，坐標(biāo)：以右側(cè)耳蝸與中縫連線(xiàn)的交點(diǎn)為原點(diǎn)，向前10 mm，再向右10 mm，深度為硬腦膜下35 mm。單次KA注射量4μg/μl/kg，注射后停針10分鐘。

7. 注射完畢后，收回注射針，縫合線(xiàn)縫合食蟹猴頭頂傷口，消毒傷口附近皮膚。將注射結(jié)束后的食蟹猴轉(zhuǎn)移到溫暖安靜的檢測(cè)室中，使用非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物固定架固定食蟹猴的四肢和頭部，卡槽留有縫隙食蟹獼猴頭部可以輕微轉(zhuǎn)動(dòng)，接下來(lái)準(zhǔn)備腦電記錄。

8. 食蟹猴腦電記錄選用Open-BCI 無(wú)線(xiàn)腦電記錄模塊。腦電記錄前使用75%酒精擦拭食蟹獼猴頭部皮膚，以去除毛發(fā)碎屑以及油脂。采用頭皮電極和對(duì)食蟹猴顳葉進(jìn)行腦電記錄。頭皮電極使用方法：將涂抹導(dǎo)電膏的杯狀電極別貼附于雙側(cè)額葉（P3/P4）、雙側(cè)顳葉（F3/F4），以枕葉中縫（Cz）作為參考，右前肢食指接地。為了排除心電干擾，于心前區(qū)放置一個(gè)盤(pán)狀電極記錄心電圖。為了排除心電干擾，心前區(qū)放置一個(gè)盤(pán)狀電極記錄心電圖。EEG采集過(guò)程中，參數(shù)分別設(shè)置為靈敏度30 μV/mm，時(shí)間常數(shù)0.3 S，濾波范圍0.5~50 Hz，采樣頻率250 Hz。

9. 腦電記錄結(jié)束后將食蟹猴放在舒適恒溫的環(huán)境中使其自然蘇醒，在此過(guò)程中密切觀(guān)察食蟹猴的呼吸和體溫，如食蟹猴有表現(xiàn)出不適應(yīng)立即聯(lián)系獸醫(yī)，食蟹猴蘇醒后放回原來(lái)的籠位，及時(shí)補(bǔ)充食物和飲水。

10. 本研究中，每只食蟹獼猴接受3~4次KA誘導(dǎo)，每周一次。

研究目的及意義

癲癇是最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，據(jù)估計(jì)，全世界范圍內(nèi)約有5000萬(wàn)癲癇患者，每年的癲癇發(fā)生率約為240萬(wàn)。我國(guó)目前約有900萬(wàn)的癲癇患者，約占全世界癲癇患者總數(shù)的1/5.

部分性癲癇患者約占癲癇患者總數(shù)的60%，部分性癲癇是指癲癇的病灶位于大腦半球中的一個(gè)或者位于一側(cè)大腦半球的局部區(qū)域內(nèi)。顳葉癲癇是部分性癲癇的常見(jiàn)類(lèi)型。顳葉癲癇患者中約有1/3的患者對(duì)于常見(jiàn)的抗癲癇藥物治療無(wú)效，這使得顳葉癲癇成了成人最難治療的癲癇類(lèi)型。對(duì)于這些患者，手術(shù)切除治療是唯一的治療選擇。顳葉癲癇手術(shù)治療前需要準(zhǔn)確定位致癲組織，手術(shù)切除時(shí)更需要完整切除致癲灶。但是由于致癲組織切除不足，仍有30%左右患者出現(xiàn)癲癇復(fù)發(fā)。對(duì)于無(wú)法準(zhǔn)確定位致癲組織的癲癇患者來(lái)說(shuō)，手術(shù)切除并不適合他們。

非人靈長(zhǎng)類(lèi)（non-human primates, NHPs）是指除了人類(lèi)以外，其他所有靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的總稱(chēng)，包括11科51屬，近400種動(dòng)物。NHPs可分為新世界猴和舊世界猴。新世界猴包括狨猴屬（Marmosets）的普通狨猴（common Marmosets）等，具有對(duì)結(jié)核病存在抵抗力，不易攜帶B病毒，無(wú)頰囊等特點(diǎn)。舊世界猴包括彌猴屬（macaque）的食蟹獼猴（Macaca fascicularis）和恒河猴（rhesusmacaque）等，其特點(diǎn)是對(duì)結(jié)核桿菌敏感，易攜帶B病毒，存在大頰囊。

嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在遺傳上只有84%基因序列與人類(lèi)相同，其生理功能和解剖結(jié)構(gòu)與人類(lèi)存在巨大差異，不能?chē)?yán)格地預(yù)測(cè)藥物的療效或?qū)θ祟?lèi)的潛在毒性。而NHPs有超過(guò)98%基因序列與人類(lèi)相同，其脾，外周血單核細(xì)胞，肝的基因組轉(zhuǎn)錄水平與人類(lèi)的相似度分別達(dá)到了91.41%，84.36%和74.29%。這種遺傳水平和生理代謝上的高度接近使NHPs成為人類(lèi)疾病研究的理想模型，特別在重性腦疾病，心血管疾病和疫苗研發(fā)等重點(diǎn)研究領(lǐng)域 。

海人酸（kainic acid, KA）是L-谷氨酸的環(huán)狀類(lèi)似物以及離子型KA受體激動(dòng)劑，最早從海藻中提取，當(dāng)作殺蟲(chóng)劑使用。KA處理神經(jīng)元可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的去極化作用最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡，這也是顳葉癲癇主要的病理表現(xiàn)。KA處理的嚙齒類(lèi)動(dòng)物最開(kāi)始具有急性期癲癇發(fā)作，隨后進(jìn)入4-5周的潛伏期，最終進(jìn)入難治性的自發(fā)性癲癇發(fā)作階段。KA處理的嚙齒類(lèi)動(dòng)物會(huì)有海馬硬化相關(guān)的病理表現(xiàn)，包括海馬神經(jīng)元丟失，顆粒細(xì)胞散布，苔狀纖維發(fā)芽等，這與顳葉癲癇患者的病理表現(xiàn)接近。

使用顳葉癲癇非人靈長(zhǎng)類(lèi)海人酸模型可以更好地模擬顳葉癲癇患者地臨床表現(xiàn)，為顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制的研究以及抗顳葉癲癇藥物的研發(fā)提供幫助。

國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展

Chen等人通過(guò)定向海馬注射KA方法成功建立顳葉癲癇恒河猴模型，研究觀(guān)察到了急性期的癲癇樣放電，包括肢體抽搐，流涎等典型癲癇癥狀，但是在慢性期監(jiān)測(cè)中沒(méi)有觀(guān)察到亞臨床癲癇發(fā)作。Perez等人報(bào)道通過(guò)全身給藥的方式注射匹羅卡品誘導(dǎo)的mTLE狨猴模型，在此模型的慢性期腦電中監(jiān)測(cè)中不僅檢測(cè)到了亞臨床癲癇樣放電還觀(guān)察到了自發(fā)性癲癇發(fā)作，但是沒(méi)有觀(guān)察到癲癇間期放電的特征圖。相比于恒河猴，食蟹猴體積小，性格溫順，容易獲得，因此食蟹猴在人類(lèi)疾病模型研究操作起來(lái)更加方便。